?純化工藝通常分為澄清、捕獲和精細純化階段——但是隨著細胞培養(yǎng)密度的不斷提高，導致Protein A柱下游產品洗脫液中HCP和DNA含量的增加，此外，病毒滅活后的濁度上升都成為了精細純化階段面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。針對這些問題，本文介紹一種能夠解決Protein A柱純化效率的整體性方法，即采用新型復合澄清膜用于純化工藝中的澄清階段。

全球單抗市場銷售額在2017年超過1000億美元，2011～2017年的復合增長率為11.5%。今后為維持這一快速增長勢頭，生物制藥行業(yè)從研發(fā)到商業(yè)化生產需要新一代的單抗生產工藝。隨著細胞培養(yǎng)基及其表達工程體系的不斷發(fā)展，目標產品表達量已達到15年前的10倍以上，對于一些難度較高的產品其表達量也取得了很大進展，純化工藝則繼續(xù)依賴于傳統(tǒng)的工藝結構。

目前的單抗純化工藝結構大部分如圖1所示：

圖1 傳統(tǒng)的單抗純化工藝

Protein A由于其與抗體Fc片段良好的特異親和性，較高的純化倍數，工藝的簡易性而被用于大多數抗體純化工藝中的捕獲階段。然而，在提高細胞培養(yǎng)密度和延長培養(yǎng)周期從而顯著提高細胞表達量的同時，Protein A柱的純化效率也從產品純度99.9%降至98%～99%。此外，Protein A柱純化的穩(wěn)定性下降導致精細純化工藝更為繁瑣。目前，因病毒滅活導致料液濁度提高以及Protein A柱產品洗脫液中HCP和DNA含量的增加，使單抗純化工藝需要更為復雜的精細純化步驟和投入更多的成本。

這里我們介紹一種新型的單抗純化方法，它通過顯著加強Protein A柱的效率從而提高單抗純化工藝的性能表現，基本上能使Protein A產品洗脫液立即達到制藥級純度。

3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清階段

關于Protein A柱性能變化的影響機制仍舊是非常熱門的研究話題，細胞發(fā)酵液中高濃度的聚集體被認為是干擾Protein A柱純化效果的主要物質，并在純化工藝的各個階段以導致聚集沉淀的媒介形式存在[1,2]。

為減少細胞發(fā)酵液中聚集體的含量，我們在澄清階段采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜來替換第二級精細深層過濾器。3M EmphazeTM AEX復合澄清膜是一款全合成產品，由高載量的Q-官能團水凝膠介質和0.2?μm 聚酰胺膜組成，能夠顯著降低細胞發(fā)酵液中的可溶性和不溶性雜質。當其用于澄清階段，可將細胞發(fā)酵液中DNA含量降低4 logs以上，通量大于400?L/m2。采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清階段的純化工藝，及3M EmphazeTM AEX復合澄清膜結構，分別見圖2，3。

圖2 采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清階段的純化工藝

圖3 3M EmphazeTM AEX復合澄清膜結構

具有層析機制的澄清解決方案

這里我們考察了將Zeta PlusTM粗級深層過濾（去除細胞）和3M EmphazeTM AEX復合澄清膜相結合應用于澄清工藝階段的性能表現。該產品形式易于放大，適用于從實驗室到生產規(guī)模的整個工藝發(fā)展流程。圖4總結了該產品組合的澄清效果。從圖中可以看到澄清后的料液濁度持續(xù)保持在0.6?FTU。且澄清后料液易通過0.2?μm或0.1?μm過濾器，隨后經Protein A柱純化。由于其獨特的結構設計，3M EmphazeTM AEX復合澄清膜處理料液過程中其壓差幾乎沒有變化，出口料液濁度也維持穩(wěn)定。

圖4 AEX復合澄清膜對于DNA及HCP去除情況

AEX復合澄清膜也能夠顯著降低細胞發(fā)酵液中DNA和HCP的含量。

Protein A柱純化后產品純度

具有層析機制的澄清工藝顯著加強了Protein A柱的捕獲效率，并就HCP和DNA含量上來講，可獲得更高純度的產品。如圖5所示，對比了采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜與僅采用傳統(tǒng)深層過濾器用于澄清工藝對于Protein A洗脫液單抗純度的影響。結果非常明顯，結合具有層析機制的澄清工藝使Protein A柱洗脫液中產品純度就HCP和DNA含量來看可接近或達到注射級標準。

我們對該工藝的平臺化進行測試，結果表明對4種不同單抗產品的純化結果非常相似。

圖5 四種不同單抗的DNA及HCP去除情況

總結

本文介紹了采用3M EmphazeTM AEX復合澄清膜用于澄清工藝的單抗純化新方法。當其替換第二級精細深層過濾器時，細胞發(fā)酵液中DNA含量降低量>4 logs，并提高Protein A柱的純化效率，使Protein A洗脫液中產品純度達到或接近注射級標準。

這種工藝改進的結果從根本上加強了工藝性能的表現，包括：

● 重建并簡化下游精細純化工藝；

● 若產品聚集體含量已足夠低的情況下，則可去除精細純化工藝和最終的病毒清除步驟。

該技術以其高穩(wěn)定性、可放大性和易于實現的特點，作為澄清工藝平臺的應用極大地幫助單抗生產掃清障礙。

【參考文獻】

[1] Gagnon.Emerging Challenges to Protein A

[P].BioProcess International, 2013.

[2] Gagnon et.Nonspecific interactions of chromatin with immunoglobulin G and protein A, and their impact on purification performance [P].Al, Journal of Chromatographic A, 2014.

文/葉璇

本文作者就職于3M中國有限公司。